安捷伦Seahorse XF糖酵解速率测定实验常见问题及解答
安捷伦Seahorse XF糖酵解速率测定实验通过测量和计算糖酵解及线粒体呼吸(CO2)导致的酸化，从而对活细胞中的糖酵解活动速率进行定量分析。该测试可以提供可靠、丰富及精确的糖酵解数据，适用于研究细胞疾病模型中的瞬时反应和代谢转换。
在实验过程中，通过采用线粒体复合物I和复合物III抑制剂(Rot/AA)来抑制呼吸(OCR)，可计算呼吸来源的质子流出速率，并将其从总的质子流出速率中减去得到糖酵解质子流出速率glycoPER。为了证实通路特异性加入糖酵解抑制剂2-DG，抑制糖酵解酸化。该测定法可准确测量基础糖酵解速率和线粒体被抑制后的补偿性糖酵解速率。通过计算并减去线粒体/TCA循环来源的CO2对细胞外酸化的贡献，所得到的糖酵解速率与乳酸累积数据具有直接的可比性。
安捷伦Seahorse XF糖酵解速率测定实验常见问题及解答
为什么要在检测液中添加HEPES，它会抑制ECAR信号吗？
低浓度的HEPES(5mM) 在实验过程中可提供稳定的缓冲能力。尽管这种低浓度的HEPES可能会轻微地降低原始的ECAR信号，但它显著地提高了ECAR信号的一致性以及转换为PER的准确性。
由二氧化碳造成的检测液酸化会影响ECAR的测量吗？
由TCA循环产生的二氧化碳对检测液的酸化可能会影响ECAR，但其在不同细胞类型中的相对贡献差异很大。通过测量加入Rot/AA前后的OCR，使用缓冲系数（Buffer Factor，BF)以及二氧化碳贡献系数（CO2 contribution factor，CCF)计算线粒体PER，从总的PER中减去后可得到glycoPER。Seahorse XF糖酵解速率测定能够报告糖酵解产生酸化的百分比，可简便地指示是否有大量的酸化来自于二氧化碳。
如何用线粒体氧消耗速率计算线粒体酸化？
线粒体氧消耗速率(mitoOCR)和源自线粒体的酸化(mitoPER)之间存在线性 关系，即二氧化碳贡献系数(CCF)，mitoPER/mitoOCR比率，在大多数类型的细胞中是恒定的。在糖酵解速率测定完成后，使用Seahorse XF糖酵解速率测定报告生成器分析时，采用预定的CCF，通过mitoOCR计算线粒体对酸化的贡献。然而，对于高氧化代谢的细胞(来自糖酵解的PER百分比<50%)，建议根据 Seahorse XF CO2 Contribution Factor Protocol User Guide重新确认具体细胞类型的CCF。(关于计算和常量推导的更多细节，请参见Agilent White Paper Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Seahorse XF Technology。http://seahorseinfo.agilent.com/acton/fs/blocks/showLandingPage/a/10967/p/p-00ca/t/page/fm/1)
该实验提供了哪些基础ECAR不能获得的信息？
在大多数情况下，基础ECAR是糖酵解一个很好的定性指标，然而，它包括来自所有酸源引起的酸化，并且未考虑检测液的缓冲能力。Seahorse XF糖酵解速率测定通过减去线粒体来源的酸化，可更精确地测量糖酵解产生的细胞外酸化。同时，以标准单位(pmol/min)报告数据。这些特性使Seahorse XF糖酵解速率测定与细胞外乳酸产量测定具有高度的可比性。
需要自己计算缓冲液系数（BF）吗?
如果使用的是推荐的检测液，则不需要。如上所述，对于标准的XF Seahorse 糖酵解速率测定检测液，缓冲液系数已确定。当使用含有某种替代成分(不同的基础培养基或底物浓度)的检测液时，应根据Seahorse XF Buffer Factor Protocol 确定缓冲系数。
必须使用不含酚红的检测液吗？为什么？
酚红干扰pH传感器，导致pH测量值低于检测液的实际pH值。虽然这并不影响原始的ECAR值，但是为了准确计算PER和glycoPER，检测液必须不含酚红。
声明：仅供研究使用，不用于诊断性操作。
版权说明：版权归原作者及安捷伦细胞团队，本文内容部分来源于美国安捷伦科技公司官网（www.agilent.com）。如有问题请联系小编，欢迎批评指正，衷心感谢！
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