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安捷伦Seahorse XF实时ATP速率测定实验常见问题及解答

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安捷伦Seahorse XF实时ATP速率测定实验可实时定量活细胞中线粒体呼吸和糖酵解的ATP生成速率。该方法利用XF技术检测线粒体有氧呼吸耗氧率(OCR)和糖酵解细胞外酸化率(ECAR)，使用经过验证的计算法将其转换为线粒体呼吸ATP、糖酵解ATP以及总ATP生成速率。

Seahorse XF实时ATP速率测定实验利用代谢的调节剂寡霉素(Oligomycin)及鱼藤酮(Rotenone)和抗霉素A (Antimycin A) 的混合物，当连续加药后可以计算线粒体和糖酵解的ATP 产生速率。

首先测量基础OCR和ECAR。加入寡霉素导致线粒体ATP合成受到抑制从而引起OCR减少，使mitoATP产生速率得以量化。ECAR数据结合检测液的缓冲系数可以计算总的质子流出速率 (PER)。用鱼藤酮和抗霉素A完全抑制线粒体呼吸能够计算线粒体相关的酸化，结合PER数据能够计算glycoATP产生速率。

OCR和ECAR测量的动力学曲线

Seahorse XF实时ATP速率测定实验常见问题及解答

如果检测液中含有不同的氧化底物(不同的P/O值)，mitoATP产生速率如何计算？

为了将ATP偶联的呼吸转换为线粒体的ATP产生速率，因此在电子传递链末端每还原一个氧原子，ADP磷酸化为ATP的化学计量学必须得到确定。不同的底物理论上最大的P/O值不同，并且依赖于化学计量学/底物氧化通路，以及F1F0 ATP合酶的效率。在标准的XF实验条件下，细胞被供给底物混合物(主要是葡萄糖、丙酮酸和谷氨酰胺)，以及内源性底物储备(糖原、脂肪酸、其他氨基酸)可用于线粒体氧化。用几种细胞系进行测试并确认P/O值2.75准确代表了外源性和内外源性氧化底物混合物的平均P/O值。(如需更多信息，请参阅白皮书：https://seahorseinfo.agilent.com/acton/fs/blocks/showLandingPage/a/10967/p/p-0157/t/page/fm/1)

当进行诱导的XF实时ATP速率测定时，诱导的速率是如何计算和报告的？

在XF实时ATP速率诱导实验中Summary Printout和Measure Sheet中的Average Assay Parameter Calculations显示的Induced Rate(s)是用急性注射和寡霉素注射之间所有测量的平均值计算的。每个时间点的诱导速率可以从Kinetic Rate Data (Measure Sheet)中获得。

XF实时ATP速率测定中定义的XF ATP速率指数是什么？

XF ATP速率指数是指mitoATP产生速率与glycoATP产生速率的比值(即mitoATP rate/glycoATP rate)。这个比值是一个细胞代谢表型的定量指标。代谢指数大于1代表大于50%的细胞ATP来自线粒体的ETC/氧化磷酸化，而指数小于1表示大于50%的总ATP是糖酵解途径产生的。因为代谢指数是比值测量，所以它对于代谢表型的改变或转换是高度敏感的。

为什么相同细胞类型的细胞以不同的密度种板时XF ATP速率不一样？

细胞的代谢表型会被细胞对ATP的需求所影响。一般来说，处于增殖或分化中的细胞比融合(缓慢生长)或末端分化的细胞拥有更高的糖酵解速率。为了比较实验之间的结果，推荐在整个研究过程中保持一致的细胞培养条件和细胞接种密度。

为什么必须用Seahorse XF DMEM培养基，pH 7.4或Seahorse XF RPMI培养基，pH 7.4来进行这个实验？

使用预调pH到7.4的XF DMEM或XF RPMI培养基节省了实验准备的时间，确保XF实验过程中一致的检测液pH值。另外，GlycoATP产生速率的计算需要对XF实时ATP速率测定中的糖酵解质子流出速率进行绝对测量。为了正确计算PER，检测液必须要有一个固定的缓冲能力。培养基中低浓度的HEPES在实验的时间范围内提供了一致的缓冲能力值。虽然添加HEPES缓冲液轻微地减少了ECAR信号，但是它显著提高了ECAR数据的质量和一致性，以及转换为PER 的准确性(更多详情，请参阅White paper:Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology)。

能够使用其他的Seahorse XF检测液来运行XF实时ATP速率测定吗？

GlycoATP产生速率的准确计算需要使用一种没有酚红和碳酸氢钠且低浓度HEPES缓冲液的检测液。因此，强烈推荐使用安捷伦Seahorse XF DMEM(或RPMI)，pH7.4的培养基。任何偏离推荐的培养基和补充剂(葡萄糖、丙酮酸钠、谷氨酰胺)，需要根据经验(使用XF分析仪)确定每个实验的缓冲系数(参阅 Seahorse XF Buffer Factor Protocol以进一步了解信息)。任何含有酚红的检测液不能在XF实时ATP速率测定中使用。

当运行诱导的XF实时ATP速率测定时，寡霉素注射之后的OCR高于基础 OCR，发生了什么？

在寡霉素注射之前加入的化合物使电子传递与氧化磷酸化解偶联(如FCCP、DNP 等)，通常会导致OCR增加。然而，这种呼吸不与ATP的产生偶联，因为没有ATP合酶的参与，线粒体膜电位会减少或消除，所以在这种环境下很少或没有ATP生成。在这些情况下，基础的mitoATP产生速率不能够被准确计算。如果怀疑存在解偶联化合物，那么推荐添加一组对照组，注射检测液+溶剂来计算基础的mitoATP产生速率。