利用实时细胞能量代谢分析评估T细胞的生物能量代谢平衡和备用呼吸能力

摘要

安捷伦 Seahorse XF T 细胞代谢分析试剂盒是一款能实时全面评估 T 细胞代谢的强大解决方案。代谢已经逐渐被认为是细胞命运和功能的关键驱动因素。研究表明，T 细胞的代谢重编程可以作为一种提高过继性 T 细胞疗法抗肿瘤有效性的策略。XF T 细胞代谢分析试剂盒支持同时测量 T 细胞群中的糖酵解和线粒体活性，并测量线粒体呼吸能力。XF T细胞代谢分析试剂盒使用了一种改进的解偶联剂 (BAM15)，能够使 T 细胞生物能量代谢能力的测量结果更一致、更准确。

前言

T 细胞在活化和分化为效应细胞和记忆细胞的过程中会发生一系列的代谢表型变化，这些变化对维持 T细胞的功能至关重要。初始 T 细胞处于静止状态，代谢需求低，主要由线粒体呼吸维持。抗原刺激诱导静止状态改变，营养吸收加快，合成代谢增强，线粒体代谢发生重编程。这些代谢变化对于支持 T 细胞快速增殖和分化以产生引发细胞毒性的细胞因子或分子至关重要。在成功清除抗原刺激后，剩余的分化记忆 T 细胞恢复到更安静的表型，主要表现为线粒体呼吸活性和高备用呼吸能力 (SRC)。在长期刺激或代谢抑制环境下，T 细胞会出现代谢功能障碍 ― 一种称为T细胞耗竭的状态，此时T细胞显示出线粒体生物能量代谢能力和效应功能的下降（图1）。

图1.T 细胞能量代谢的基本原理和T细胞代谢表型的测量，展示了糖酵解/ OXPHOS 比例与细胞命运、适应性和功能之间的关系。在长期刺激或抑制物存在的环境下（如肿瘤微环境），T 细胞可发展为耗竭表型，且线粒体功能受损

全新安捷伦 Seahorse XF T细胞代谢分析试剂盒的开发

为能同时获得 T 细胞群糖酵解和线粒体活性准确、一致的定量生物能量代谢测量结果，安捷伦开发了Seahorse XF T 细胞代谢分析试剂盒。该试剂盒可通过解偶联剂 BAM15 准确测量 T细胞的最大呼吸能力。BAM15是一种新型解偶联剂，其效力与 FCCP 相似，但细胞毒性更小，对质膜的亲和力更低，因此具有更广泛的应用范围。

图2.Seahorse XF T细胞代谢分析试剂盒

使用XF T 细胞代谢分析试剂盒（配备 BAM15解偶联剂）计算得到的 glycoATP 产生速率和使用安捷伦 Seahorse XF 实时 ATP 速率测定试剂盒得到的结果进行了比较。结果表明，从这两种试剂盒或测定中得到的基础 glycoATP 产生速率没有显著差异。

图3.使用安捷伦 Seahorse XF 实时 ATP 速率测定试剂盒 (B) 或 XF T 细胞代谢分析试剂盒 (A) 计算得到的 T 细胞的基础 glycoATP 产生速率（以 BAM15 为解偶联剂）

XF T细胞代谢分析试剂盒在优化 T 细胞治疗产品持久性中的应用

在评估CAR-T和其他过继性T细胞疗法时，需要考虑的一个关键属性是细胞的代谢特征，因为它在决定 T 细胞持久性和抗肿瘤功能中起至关重要的作用。据报道，在体外扩增过程中获得高代谢活性效应表型的CAR-T细胞在体内表现出较差的持久性和抗肿瘤活性。然而，在体外扩增过程中表现出低到中等代谢活性和高备用呼吸能力的 CAR-T 细胞则具有良好的抗肿瘤免疫功能，表现为更强的增值能力、更高的肿瘤细胞杀伤速率及细胞因子产生速率。有研究表明，生产过程中的不利扩增条件可能会产生不良代谢表型的 T 细胞产品，进而导致体内效力降低。这些研究还指出，T 细胞在扩增过程中的代谢调节可以诱导代谢重编程，从而延长体内持久性并增强抗肿瘤功能。

XF T细胞代谢分析试剂盒旨在协助 T细胞疗法的开发，仅一次检测即可提供 T细胞代谢特性的完整信息，包括总的基础能量需求、基础代谢平衡和备用呼吸能力，所有参数都曾被用以描述持久性增加或降低的 T 细胞代谢状态。因此，它是评估和优化 T 细胞扩增条件的理想选择，从而得到所需的 T 细胞持久性更好的代谢表型。

下面的研究中，使用 XF T 细胞代谢分析试剂盒评估了不同细胞培养基成分（含10 mmol/L 葡萄糖 + 10% FBS 的 RPMI 或 ImmunoCult XF 培养基 (STEMCELL Technologies)）和不同白介素（IL-2 或 IL-15）添加对 T 细胞产品代谢的影响。以往的研究表明，与 IL-2 中培养的细胞相比，IL-15 中扩增的细胞具有更低的分化表型。在本研究中，用 CD3/CD28 抗体偶联的磁珠活化来自不同健康人类供体的 pan T 细胞。三天后将磁珠去除，细胞在指定的培养基条件下扩增（图 4）。将细胞以 1 × 10⁶ 细胞/mL的密度培养，每三天更新一次培养基并调整容量。在第 7、14、22天取样，在建议的检测条件下，使用 XF T细胞代谢分析试剂盒进行 XF T细胞持久性检测。首先，比较了细胞扩增过程中的 SRC。如图 4A 所示，在第7天观察到在 IL-15或 IL-2中扩增细胞的SRC 差异，这与扩增使用的细胞培养基无关。在第22天，IL-15 中扩增细胞的SRC 增加变得明显，尤其是在优化的 ImmunoCult XF 培养基中培养的细胞（图4C）。高SRC是记忆样表型的特征，此前被认为与高持久性有关。

下一步是分析该方法得到的额外数据，即糖酵解和线粒体的基础 ATP 产生速率，以更好地表征和改善扩增条件（图4，每张插图的下两图）。与在含 IL-2 的 ImmunoCult XF 培养基中扩增的细胞相比，在含 IL-15 的培养基中扩增的细胞具有更好的氧化代谢平衡，即糖酵解产生的 ATP 占比更低（图4，每张插图的右下图，黄色和紫色的柱）。此外，无论使用哪种白介素，与在 ImmunoCult XF 培养基中扩增和分化的细胞相比，在 RPMI 培养基中扩增和分化的细胞都具有更高的代谢需求，即总基础ATP 产生速率更高（图 4，每张插图左下图）。 高代谢需求与效应 T 细胞表型相关。

图 4. 细胞扩增条件对 T 细胞代谢测量的影响。在 ImmunoCult XF T 细胞扩增培养基中用人活化剂 CD3/CD28 活化人外周血 pan T细胞，并在 5% CO₂ 的培养箱中，于 37 °C 条件下培养。活化三天后，去除活化剂，将细胞分为 4 组，按 1 × 10⁶ 细胞/mL 重悬于以下 4 种培养基中：蓝色 ― RPMI 添加 2 mmol/L 谷氨 酰胺、10% FBS 和 IL-2 (300 U/mL)；绿色 ― RPMI 添加 2 mmol/L 谷氨酰胺、10% FBS 和 IL-15 (10 ng/mL)；紫色 ― ImmunoCult XF 培养基添加 IL-2 (300 U/mL)；黄色 ― ImmunoCult XF 培养基添加 IL-15 (10 ng/mL)。在活化后第 7 天、14 天和 22 天采集样品并分析。每天报告的数据包括 OCR 动力学曲线（左上）、SRC（右 上）、ATP 产生速率（左下）和糖酵解产生的 ATP 百分比（右下）

结论

XF 分析仪和 XF T 细胞代谢分析试剂盒结合，是T 细胞代谢特性完整表征的优化方法，提供了优化的解偶联剂，实现了对 T 细胞最大呼吸和备用呼吸能力的可靠测量，且仅需极少的解偶联剂浓度优化。此外，该方法能使用户获得同一细胞样品糖酵解活性的定量信息以及提供对细胞基础能量需求的独特测量。

声明：仅供研究使用，不用于诊断性操作。

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