安捷伦 XF 底物氧化压力测试试剂盒

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安捷伦Seahorse XF 底物氧化压力测试试剂盒是一套用于测定细胞内底物氧化的优化解决方案,通过评估活细胞中耗氧率(OCR) 的变化来测定细胞底物氧化。这套分析方法可以研究细胞如何氧化 3 种主要的线粒体底物:长链脂肪酸 (LCFA)、葡萄糖/丙酮酸和/或谷氨酰胺,有助于研究细胞如何通过改变或转变特定底物的氧化,从而执行激活、增殖和分化等关键细胞功能,并对遗传干预、药物干预或微环境生存做出响应。

主要的代谢通路

实验简介:

LCFA、葡萄糖/丙酮酸和谷氨酰胺是线粒体代谢的3种主要底物。许多领域 (如癌症、免疫学、干细胞生物学)的研究人员已经证明了这些底物的氧化如何对细胞命运、功能和适应性产生深远影响。利用特定底物氧化通路的抑制剂进行XF细胞线粒体压力测试,在底物需求较少(即基础呼吸)和底物需求较多(即最大呼吸)的条件下研究细胞,测定基础呼吸参数、对抑制剂的急性响应以及最大呼吸参数,对线粒体进行全面评估。虽然在基础条件下可以检测到较小的变化,即急性响应,但在高底物需求条件下(如FCCP),往往会出现更大的响应,从而显示出细胞氧化所研究底物能力的差异。

 

安捷伦 Seahorse XF标准底物氧化分析和相关分析参数的动力学曲线

实验策略:

XF 底物氧化压力测试将XF 细胞线粒体压力测试 (MST) 与下列底物通路特异性抑制剂相结合:

乙莫克舍 (Eto) 通过抑制肉毒碱棕榈酰基转移酶1a (CPT1a) 来抑制 LCFA 的氧化。

UK5099 通过抑制线粒体丙酮酸载体蛋白 (MPC) 来抑制葡 萄糖或丙酮酸的氧化。

BPTES 通过谷氨酰胺酶 1 (GLS-1) 抑制谷氨酰胺的氧化。 注意,BPTES 不能抑制谷氨酰胺酶 2 (GLS2)

词汇表:

基础呼吸:用于满足细胞 ATP 需求的耗氧量和线粒体质子渗漏所致的耗氧量。显示基础条件下细胞的底物需求

急性响应:由于加入底物氧化抑制剂(EtomoxirUK5099BPTES)而引起的耗氧率变化。 报告为 OCR 变化 (即 ΔOCR pmol/min

最大呼吸:加入解偶联剂 FCCP 获得的最大耗氧率。FCCP 通过刺激呼吸链在最大能力下工作 来增加对底物的需求,这会导致底物(糖、脂肪和氨基酸)的快速氧化来应对这一代谢挑战。 显示细胞在最大呼吸条件下的底物需求

非线粒体呼吸:在添加鱼藤酮/抗霉素 A 后,由于一些细胞酶继续消耗氧气而持续产生氧消耗。这对于准确测量线粒体呼吸非常重要。

标准底物氧化压力测试工作流程:3 种互补性分析,每种分析都侧重于使用相关抑制剂 Etomoxir UK5099 BPTES)在优化浓度下测试细胞对单个底物 LCFAs G/P Q)的需求。在检测液中的葡萄糖、丙酮酸钠和谷氨酰胺底物饱和的条件下进行分析。

MSTXF 细胞线粒体压力测试是一种广受认可的分析方法,通过报告线粒体呼吸的多个参数,全面了解线粒体功能。

FAO:脂肪酸氧化

Etomoxir一种长链脂肪酸氧化抑制剂。Etomoxir 抑制肉毒碱棕榈酰基转移酶 1a (CPT1a),该酶对于长链脂肪酸从细胞质基质转移至线粒体进行 β 氧化至关重要。注意,浓度超过 4 μmol/L(终浓度)会对线粒体呼吸产生严重的脱靶效应。

UK5099一种葡萄糖氧化通路抑制剂。UK5099抑制线粒体丙酮酸载体蛋白 (MPC),该蛋白可以将丙酮酸转运到线粒体中。细胞通过糖酵解将葡萄糖转化为丙酮酸。丙酮酸可以转运到线粒体中,并通过 TCA 循环氧化

BPTES一种谷氨酰胺氧化通路抑制剂。BPTES是谷氨酰胺酶 (GLS1) 的变构抑制剂。谷氨酰胺酶将谷氨酰胺转化为谷氨酸,然后谷氨酸转化为 α -酮戊二酸,并通过 TCA 循环氧化。

LCFAs长链脂肪酸

G/P葡萄糖/丙酮酸

Q谷氨酰胺

了解底物的依赖性对于开发许多疾病的治疗方法是至关重要的。安捷伦 Seahorse XF 底物氧化压力测试可以提供基础呼吸数据以及基础底物需求条件下通路抑制的影响,同时还能表征通路抑制对最大呼吸的影响,反映在较高的底物需求下,细胞对特定代谢通路损伤的敏感性。由于许多类型的细胞都具有代谢可塑性,在高需求条件下,评估底物依赖性通常可以获得更丰富的信息,揭示细胞的底物利用能力。当研究细胞是否需要特定的底物时,或者研究应用于细胞的某种干预措施是否影响线粒体对特定底物的氧化时,建议使用这套实验设计。

线粒体底物氧化驱动细胞表型和功能/功能障碍的示例

声明:仅供研究使用,不用于诊断性操作。

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下面网址是安捷伦Seahorse XF分析学习中心:https://www.agilent.com.cn/zh-cn/products/cell-analysis/how-to-run-an-assay,访问可获取更多资源。

2023年2月17日 10:59
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